Neuroprotective Effects of Mitoquinone and Oleandrin on Parkinson’s Disease Model in Zebrafish

İsmail Ünal, Esin Çalışkan-Ak, Ünsal V. Üstündağ, Perihan S. Ateş, Ahmet A. Alturfan, Meric A. Altinoz, Ilhan Elmaci & Ebru Emekli-Alturfan

To cite this article: İsmail Ünal, Esin Çalışkan-Ak, Ünsal V. Üstündağ, Perihan S. Ateş, Ahmet A. Alturfan, Meric A. Altinoz, Ilhan Elmaci & Ebru Emekli-Alturfan (2019): Neuroprotective Effects

of Mitoquinone and Oleandrin on Parkinson’s Disease Model in Zebrafish, International Journal of Neuroscience, DOI: 10.1080/00207454.2019.1698567

To link to this article: https://doi.org/10.1080/00207454.2019.1698567

Accepted author version posted online: 26 Nov 2019.

Submit your article to this journal

Article views: 12

View related articles

View Crossmark data

Full Terms & Conditions of access and use can be found at

https://www.tandfonline.com/action/journalInformation?journalCode=ines20

Neuroprotective Effects of  Mitoquinone and Oleandrin on Parkinson’s Disease

Model in Zebrafish

İsmail Ünal 1, Esin Çalışkan-Ak 2, Ünsal V. Üstündağ 3,  Perihan S. Ateş 1, Ahmet A. Alturfan 4, Meric A.Altinoz 5, Ilhan Elmaci 6, Ebru Emekli-Alturfan1*

1Department of Biochemistry, Faculty of Dentistry Marmara University, Istanbul, Turkey

2Department  of  Histology  and  Embryology,  Faculty  of  Dentistry,  Marmara University, Istanbul, Turkey

3Department of Biochemistry, Faculty of Medicine, Istanbul Medipol University, Kavacık, Istanbul, Turkey

4Department of Biochemistry, Cerrahpasa Medical Faculty, Istanbul University, Fatih, Istanbul, Turkey

5Department of Biochemistry, Acibadem University, Istanbul, Turkey 6Department of Neurosurgery, Acibadem University, Istanbul, Turkey Running head: Mitoquinone and Oleandrin in Parkinson’s Disease *Corresponding author: Prof.Ebru Emekli-Alturfan, e-mail: ebrualturfan@gmail.com

Abstract

The aim of this study is to investigate the possible protective effects of mitoquinone and oleandrin on rotenone induced Parkinson’s disease in zebrafish. Adult zebrafish were exposed to rotenone and mitoquinone for 30 days. Biochemical parameters were determined  by  spectrophotometric  method  and  Parkinson’s  disease-related  gene expressions  were  determined  by  reverse  transcription  polymerase  chain  reaction method. Measurement of neurotransmitters was performed by liquid chromatography tandem-mass   spectrometry   instrument.   The   accumulation   of   synuclein   was demonstrated by immunohistochemical staining. In vitro thiazolyl blue tetrazolium bromide   method   was   applied   to   determine   the   mitochondrial   function   of synaptosomal brain fractions using rotenone as a neurotoxic agent and mitoquinone and  oleandrin  as  neuroprotective  agents.   Mitoquinone  improved  the  oxidant- antioxidant  balance  and  neurotransmitter  levels  that  were  disrupted  by  rotenone. Mitoquinone also ameliorated the expressions of Parkinson’s disease-related gene expressions that were disrupted by rotenone. According to thiazolyl blue tetrazolium bromide assay results, mitoquinone and oleandrin increased mitochondrial function which was decreased due to rotenone exposure. Based on the results of our study, positive effects of mitoquinone were observed in Parkinson’s disease model induced by rotenone in zebrafish.

Key words: Zebrafish, Parkinson’s Disease, Mitoquinone, Oleandrin

INTRODUCTION

Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder in the world [1]. PD is a progressive condition characterized by motor symptoms such as tremors at rest, slowing movements, stiffness in the face, hands, and legs, and balance disturbances [2]. PD is caused by a decrease in dopaminergic neurons in the compact part of the substantia nigra (SN). Dopamine-producing neurons die in 60-80 % of SN and dopamine amount in putamen is reduced by 80% leading to the typical symptoms of PD [3,4].

Mitochondrial damage, oxidative stress, neuroinflammation, decreased neurotrophic factors, protein accumulation, apoptosis, and dopamine loss have been reported as effective mechanisms in the development of PD [5]. It has been accepted that genetic components also play an important role in the development of PD [6]. PD genetics studies have shown that PD is associated with alpha synuclein mutations, the most important factor in lewy bodies formation, which are cytoplasmic residues in neurons [7].

In order to prevent mitochondrial damage, antioxidants targeting mitochondria have come to the fore in recent years. Mitoquinone, the most interesting antioxidant for mitochondria, is located in the mitochondria and has been reported to  be highly effective in protecting against mitochondrial oxidative damage [8]. In recent years, it has been suggested that oleandrin which is the active ingredient of Nerium oleander has neuroprotective activity [9,10].

Zebrafish (Danio rerio) is a small tropical freshwater fish with increasing  popularity as a model organism in human diseases today [11]. Zebrafish is defined as an ideal vertebrate model that can be monitored embryologically and genetically. It differs from classical vertebrate models due to its high genetic and organ homology with the human, transparent embryo, small size, short development and production time, high number of eggs (over 200 / female / week) production and low maintenance costs [12]. In zebrafish, dopaminergic neurons are first detected in a set of cells in the posterior tubercle of the ventral diencephalon between 18-19 hours after fertilization [13]. Genetic and neurotoxin models have been successfully applied to produce PD in zebrafish [14].

The   aim   of   this   study   was   to   investigate   the   effects   of   mitoquinone   on neurotransmitter   levels,   PD-related   genes   and   synuclein   expression,   oxidant- antioxidant status and locomotor activity in rotenone-induced PD model in zebrafish. In  addition,  the  effects  of  oleandrin  and  mitoquinone  were  also  evaluated  on mitochondrial activity in the synaptosomal fractions of rotenone exposed zebrafish brains.

EXPERIMENTAL PROCEDURES Animals and treatment

Wild-type male and female AB/AB strain zebrafish were maintained in disease-free conditions. Zebrafish were housed in an aquarium rack system (ZebTEC, Tecniplast, Italy) at 27  ± 1 °C under a light/dark cycle of 14/10 h. All experimental procedures were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of Marmara University. Zebrafish were randomly divided into four groups; the control group (C) (n=7), rotenone group (R) exposed to 5 μg/L rotenone dissolved in 0.1 % dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma, USA) (n=7), mitoquinone group (MQ) exposed to 1mg/L mitoquinone dissolved in 0.1 % DMSO (n=7) and rotenone + mitoquinone group (R+MQ) exposed to 5 μg/L rotenone+1mg/L mitoquinone dissolved in 0.1 % DMSO, (n=7) for 4 weeks. C group was exposed to a solution of 0.1 % DMSO. At the end of the   experiment   after   the   determination   of   the   locomotor   activity  fish   were anesthetized and brain tissues were taken and used for the analyses.

Locomotor Activity Determination

Fish  swim  back  and  forth  along  the  length  of  the  tank  as  normal  behavior. Accordingly, the locomotor activity of adult zebrafish was determined in a 2 L tank in which three vertical lines were drawn on it at equal distances, dividing the tank into four zones (the length of each zone was 6.25 cm). The number of lines that adult zebrafish  crossed  was  measured  for  5  min  and  the  total  distance  that  the  adult zebrafish traveled was in direct proportion to the total number of lines that the fish crossed [15].

Neurotransmitters Analysis

The levels of dopamine, serotonin, 3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) and noradrenaline in brain tissues were determined by liquid chromatography tandem- mass spectrometry (LC-MS/MS) in homogenates filtered from syringe filter. For this

purpose, brain tissues were homogenized with 0.4 M perchloric acid and homogenates were centrifuged at 13,000 g for 20 min. [16].

Biochemical Analysis

Total protein level was determined by the method of Lowry. Briefly, alkaline proteins are reacted with copper ions and then reduced by Folin reactive. The absorbance of the product was evaluated at 500 nm by a spectrophotometer and calculated to express the results of the parameters per protein [17].

The method of Yagi was used to determine malondialdehyde (MDA) level, an end product of lipid peroxidation (LPO), as thiobarbituric acid reactive substances. LPO was expressed in terms of MDA equivalents as nmol MDA/mg protein [18].

Nitric oxide (NO) was determined by the method of Miranda which is based on reducing  nitrate  to  nitrite  by vanadium  (III)  chloride.  The  colored  complex  was measured at 540 nm by a spectrophotometer and results were expressed as nmol NO/mg protein [19].

Superoxide dismutase (SOD) activities were determined by the method based on the ability of SOD to increase the effect of riboflavin-sensitized photo-oxidation of o- dianisidine.  At  460  nm  absorbances  at  0  and  8th  minutes  of  illumination  were measured and the net absorbance was calculated. Bovine SOD (Sigma Chemical Co, S2515-3000 U) was prepared as the reference and the results were expressed in U/mg protein [20].

Glutathione-S-transferase  (GST)  catalyzes  the  conjugation  of  glutathione.  The absorbance of the mixture at 25oC is measured by spectrophotometer at 340 nm [21]. Reverse Transcription (cDNA synthesis) and Quantitative Real-Time PCR

RNA was isolated from brain tissues using Rneasy Mini Kit and Qiacube (Qiagen). Single-stranded cDNA was synthesized from 1 μg of total RNA using RT2  Profiler PCR Arrays (Qiagen). PCRs were performed using the DNA Master SYBR Green kit (Qiagen). PCRs were performed using the DNA Master SYBR Green kit (Qiagen). The expression of pink1, dj-1, lrrk2, prkn and bdnf were evaluated by quantitative RT-PCR using the Qiagen Rotor Gene-Q Light Cycler instrument. β-actin was used as the housekeeping gene. Relative transcript levels were calculated using the Delta- Delta CT (DDCT) method by normalizing the values to the housekeeping gene [22]. Immunohistochemical Analysis

Brain samples were fixed with 10 % neutral buffered formalin for 24 hours and routinely processed for paraffin embedding. Tissue sections of 3 µm were washed with PBS and nonspecific binding of antibodies was blocked by incubation in a blocking solution. Primary antibody (γ Synuclein, Sigma HPA014404 Anti-SNCG antibody)  was  incubated  for  overnight  at  +40   C. Sections  were  washed  with phosphate-buffered   saline,   followed   by  incubation   Goat-anti-Rabit   horseradish peroxidase-conjugate. The  labeling  was  revealed  by  incubation  with  a  freshly prepared solution of 3.3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) solution. The sections were counterstained with Mayer’s hematoxylin, dehydrated and mounted with  entellan.  To  test  the  specificity  of  the  staining,  the  primary  antibody  was replaced with non-immune serum in negative control sections. Staining sections were examined and photographed with a digital camera (DP72; Olympus) attached to a photomicroscope (BX51; Olympus).

Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Analysis

The MTT reduction test is an in vitro assay for measuring mitochondrial metabolic function (measuring cell viability). In vitro analysis of MTT using rotenone as a neurotoxic agent was performed in the synaptosomal fractions prepared from the brains of zebrafish. Brain tissues of 50 zebrafish were removed under anesthesia and homogenized   in   0.32   M   sucrose   solution.   The   pellet   formed   after   various centrifugation steps of the homogenates was suspended with HEPES buffer. The solution containing the synaptosomal fraction was divided into eppendorfs (400 μl). Rotenone (1mM) was added as the neurotoxic agent and the protective effects of oleandrin (10 mg / L and 100 mg / L) and mitoquinone (1 mg / L) were evaluated. The solutions were kept in the dark for 2 hours at 28 oC. MTT dissolved in HEPES was added to each eppendorf at the end of the period and this mixture was kept in darkness for 4 hours at 28oC. DMSO was added to the pellets and the absorbance of the purple colored liquid was measured spectrophotometrically at 570 nm. The results were evaluated proportionally as 100% viability of the control [23,24].

STATISTICS

Statistical analysis was carried out using GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, USA). All data were expressed as the mean ± standard deviation. Kruskal Wallis  test  was  used  for  the  comparison  of  groups  of  data  followed  by Dunn’s multiple comparison tests. Value of P less than 0.05 was regarded as significant.

RESULTS

Results of Locomotor Activity

The  locomotor  activity  of  R,  MQ  and  R  +  MQ  groups  significantly  decreased compared to the C group (p <0.05). In addition, the locomotor activity of the R + MQ group decreased significantly compared to the MQ group (p <0.05) (Figure 1).

Results of Neurotransmitters Analysis

There was a significant decrease in R group dopamine level compared to group C (p

<0.05). In the R + MQ group, the dopamine level significantly increased compared to the R group (p <0.05). DOPAC level of R group significantly increased compared to C group (p <0.05). There was a significant decrease in DOPAC level compared to the R group in the MQ and R + MQ groups (p <0.05).It was determined that R group had a  significant   decrease   in   serotonin  levels  compared   to   group  C   (p  <0.05). Noradrenaline levels were not significantly different between the groups (p >0.05) (Figure 2).

Results of Biochemical Analysis

LPO levels significantly increased in R group when compared with the C group (p

<0.05) (7.93 ± 0.61 nmol MDA/mg P; 3.61 ± 0.39 nmol MDA/mg P respectively). In the MQ group, LPO levels significantly decreased compared to both R and C groups (p <0.05) (1.89 ± 0.53 nmol MDA/mg P; 7.93 ± 0.61 nmol MDA/mg P; 3.61 ± 0.39 nmol MDA/mg P respectively). LPO levels significantly decreased in R + MQ group compared to R group (p <0.05) (3.87 ± 0.28 nmol MDA/mg P; 7.93 ± 0.61 nmol MDA/mg P respectively) .

There  was  a  significant  decrease  in  the  SOD  activity of  the  R  and  MQ  groups compared to the C group (p <0.05) (2.02 ± 0.25 U/min mg P; 2.05± 0.29 U/min mg P; 2.77±0.18 U/min mg P respectively). SOD activity in R + MQ group significantly increased compared to both R and MQ groups (p <0.05) (2.76 U/min mg P;  2.02 ± 0.25 U/min mg P; 2.05± 0.29 U/min mg P respectively) (Figure 3).

There was a significant decrease in GST activity in R, MQ and R + MQ groups compared to C group  (p <0.05) (0.032 ± 0.002 U/min mg P; 0.038± 0.004 U/min mg

P; 0.045± 0.001 U/min mg P and 0.05 ± 0.005 U/min mg P respectively). In the R + MQ group, GST activity significantly increased compared to the R group (p <0.05). NO  levels  increased  significantly in  the  R  group  compared  to  the  C  group  and decreased in the MQ group (p <0.05) (3.12 ± 0.10 μmol/g P; 2.6 ± 0.12 μmol/g P; 1.7±0.19 μmol/g P). NO levels significantly decreased in MQ and R + MQ groups compared to R group (p <0.05) (1.7±0.19 μmol/g P; 2.82±0.2 μmol/g P; 3.12±0.1 μmol/g P respectively). In the R + MQ group, the NO levels  significantly increased compared to the MQ group (p <0.05) (Figure 3).

Results of Quantitative Real-Time PCR

When compared with the C group, there was a significant decrease in the expression of prkn in the R group (p <0.05). In the MQ group,  prkn expressions significantly increased compared to both C and R groups (p <0.05). In the R + MQ group, the expression level of prkn significantly increased compared to the R and C group but significantly decreased compared to the MQ group (p <0.05).

pink1 expression significantly decreased in group R compared to group C (p <0.05). pink1 expression significantly increased in both MQ and R + MQ groups compared to both group C and R groups (p <0.05).

In group R, the expression dj-1 significantly increased compared to C group   (p

<0.05). In both MQ and R + MQ groups, dj-1 expression significantly decreased compared to both C and R groups (p <0.05).

In the R group, the expression lrrk2 significantly increased compared to the C group (p <0.05). The levels of lrrk2 expression significantly decreased in both MQ and R + MQ groups compared to both the C group and the C group (p <0.05).

There was a significant decrease in bdnf expression in group R compared to group C (p <0.05). bdnf expression significantly increased in the MQ group compared to both the C and the R groups (p <0.05). The expression bdnf significantly decreased in the R  +  MQ  group  compared  to  the  C  and  MQ  groups  and  increased  significantly compared to the R group (p <0.05) (Figure 4).

Results of Immunohistochemical Analysis

Immunohistochemical staining of rhombencephalon samples in the control and MQ group showed moderate immunopositive staining in nerve cell bodies and processes. In R group, strong γ Synuclein immunopositive staining was observed in nerve cell bodies and processes while the intensity of γ Synuclein immunopositive staining decreased in R+MQ group (Figure 5).

Results of MTT Analysis

MTT analysis results of C, MQ, R, Oleandrin 10 mg / L (OL10), Oleandrin 100 mg /

L (OL100), Rotenone - Oleandrin 10 mg / L (R + OL10), Rotenone - Oleandrin 100 mg / L (R + OL100) and R + MQ groups are shown in Figure 6. Formazon formation showing mitochondrial activity significantly decreased in R, R + OL10, R + OL100 and  R  +  MQ  groups  compared  to  C  group  (p  <0.05).  Mitochondrial  activity significantly increased in the OL100 group compared to the C group (p <0.05). There was a significant increase in the formation of formazan in R + OL100 and R + MQ groups compared to the R group (p <0.05). There was a significant decrease in the formation of formazan in R, R + OL10, R + OL100 and R + MQ groups when compared with the MQ group (p <0.05). On the other hand, there was a significant decrease in mitochondrial activity in R + OL10, R + OL100 groups compared to OL10 group (p <0.05) (Figure 6).

DISCUSSION

In  our  study,  amendatory  effects  of  mitoquinone  against  rotenone  induced  PD symptoms  were  observed.  Mitoquinone  positively  affected  the  impaired  oxidant- antioxidant balance, altered PD-related gene and synuclein expressions.

At the end of 4-weeks of rotenone application, locomotor activity, dopamine, and serotonin levels significantly decreased whereas DOPAC and DOPAC / dopamine levels significantly increased in rotenone exposed zebrafish when compared to the control group. Noradrenaline levels were not significantly different. The expression of synuclein in the brain increased as observed by immunohistochemical staining. In addition, increased LPO and decreased antioxidant levels in the brain tissue showed deteriorated oxidant-antioxidant balance.

Rotenone is a pesticide that can cross the blood brain barrier unlike many other toxic agents due to its lipophilic nature. When it enters the cell, it accumulates in organelles including mitochondria.  In the mitochondria, it  binds  to  complex  1 and disrupts mitochondrial respiration, and it causes oxidative stress by increasing reactive oxygen species (ROS) production [14,16]. Rotenone is commonly used to produce PD-like symptoms in rodents, but there is a limited number of studies investigating rotenone application  as  a  PD  model  in  zebrafish.  Wang  et  al.  [16]  reported  that  4-week rotenone  administration caused  motor and  non-motor PD-like symptoms  in  adult zebrafish. Rotenone-treated   zebrafish   showed a decrease in swimming speed as a

sign of impairment in motor function. In the light-dark box test, rotenone-treated zebrafish  spent  more  time  in  the  bright  compartment  reflecting  anxiety  and depression-like   behavior.   In   addition,   rotenone-treated   fish   showed   olfactory dysfunction. These symptoms  are related to  the reduction of dopamine levels  in zebrafish brain. In another study, Khotimah et al. [25] exposed adult zebrafish to 5 μg

/ L rotenone for 28 days and reported significantly decreased motility and dopamine content  in  the  brain.  In  our  study,  similar  to  these  studies  5  μg  /  L  rotenone administration for 4 weeks caused PD-like symptoms in zebrafish. Although rotenone administration  decreased  dopamine,  serotonin  levels  and  increased  DOPAC,  and DOPAC / Dopamine levels, noradrenaline levels did not change. Previous studies with  rotenone-induced  PD  did  not  show  a  relationship  between  depression-like behaviors and noradrenaline levels [26]. It was reported that anxiety and depression- like behaviors in PD were associated with dopamine and not related to noradrenalin or serotonin [16].

The number of studies investigating the effects of mitoquinone in neurodegenerative diseases such as PD is quite limited. In some of these studies, the positive effects of mitoquinone  in  PD  have  been  demonstrated  in  vivo  and  in  vitro.  Mitoquinone inhibited  mitochondrial  fragmentation  by 6-hydroxydopamine  (6-OHDA)  when administered to SH-SY5Y cells [27]. In another study, the neuroprotective effect of mitoquinone   was   demonstrated   in   both   cell   culture   and   PD   animal   model. Mitoquinone has been shown to inhibit the loss of dopaminergic neurons induced by 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6  tetrahydropyridine  (MPTP)  and  to  correct  behavioral activities [28].

In   our   study,   the   administration   of   mitoquinone   positively   affected   the neurotransmitter levels which were impaired by rotenone administration. Mitoquinone significantly  increased  dopamine  levels  and  decreased  DOPAC  and  DOPAC  /

Dopamine levels in the rotenone treated group. It can be argued that these findings may be due to the effect of mitoquinone as a mitochondrial targeted antioxidant, reducing the oxidative damage and preventing the loss of dopaminergic neurons.

Our study showed alterations in the expressions of PD-related genes in rotenone exposed zebrafish. Rotenone significantly increased the expression of dj-1. It has been reported that DJ-1 acts as an oxidative stress sensor and has a neuroprotective role and increased expression of DJ-1 has been reported in stress  conditions such as oxidative stress [29, 30]. Mitoquinone administration significantly decreased  dj-1

expression  in  the  rotenone  exposed  group.  This  finding  may  suggest  that  by

decreasing oxidative stress mitoquinone also decreased dj-1 expression which was

increased in response to neurotoxic agent rotenone.

In our study, rotenone exposure was found to increase the expression of lrrk2 in zebrafish. Our findings are consistent with the results of rotenone and MPTP induced PD models in zebrafish [16,31]. Mitoquinone   significantly decreased  lrrk2 gene expression in the rotenone exposed group. Rotenone exposure resulted in significant reductions in pink1, park2 and bdnf expression levels. On the other hand, mitoquinone led to a significant increase in pink1 expression in the rotenone exposed group. This shows that the high antioxidant capacity of mitochondria would positively affect the pink1 and prkn activities. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is essential for the survival and morphology of dopaminergic neurons and loss of BDNF contributes to the death of these cells in PD [32]. In our study, bdnf expression significantly increased  with  the  application  of  mitoquinone  which  was  decreased  in  rotenone exposed zebrafish,

Synucleins  are  small  proteins  of  100-140  amino  acids  expressed  in  neuronal presynaptic terminals. The three members of the synuclein family, alpha, beta and gamma synuclein, are encoded by separate genes and are highly conserved throughout the  vertebrates.  In  zebrafish,  three  genes,  sncb,  sncg1  and  sncg2  (encode  beta, gamma1 and gamma2 synuclein), and these genes show wide phylogenetic protection with human paralogs. Synucleins in zebrafish show intense sequence similarity with human synucleins [33]. In our study, the immunohistochemical expression of gamma synucleins increased compared to the control group in the sections of the brain tissues of zebrafish exposed to rotenone. Mitoquinone administration decreased synuclein accumulation  in  the  rotenone  group.  This  condition  supports  the  importance  of increased oxidative stress in the accumulation of synuclein and the potential of the mitoquinone as an antioxidant protector.

In our study, LPO significantly increased in the brain tissues of rotenone exposed zebrafish as a sign of increased oxidative stress, while the antioxidant enzymes SOD and  GST  activities  significantly  decreased.  Impaired  oxidant-antioxidant  balance caused by rotenone is parallel to the changes in expressions of genes encoding PD- associated mitochondrial proteins. In rotenone exposed group, increased expression of prkn and pink1 together with decreased dj-1 expression is closely related to impaired oxidant-antioxidant  balance.  On  the  other  hand,  Mitoquinone  corrected  oxidant-

antioxidant balance as a mitochondria-targeted antioxidant. There was a significant increase in the SOD level of R+MQ group when compared with the MQ group. This increase may be attributed to the antioxidant effect of mitoquinone and to the defense  mechanism  of  the  organism  against  increased  LPO.  NO levels also increased significantly in the rotenone exposed zebrafish compared to the control group, on the other hand, mitoquinone decreased NO levels. As a signaling molecule, NO plays an important role in a variety of signal transduction pathways that are very important for maintaining the physiological functions of the vascular, respiratory, immune,  muscle  and  nervous  systems.  NO  and  its  derivatives  play  a  role  in pathogenic processes of neurodegenerative disorders [34].

When in vitro-MTT analysis was performed using synaptosomal fractions prepared from zebrafish brains using rotenone as a neurotoxic agent, mitochondrial activity significantly decreased.  Rotenone  is  a  specific  inhibitor  of  MCI,  also  known  as NADH: ubiquitin oxidoreductase, causing depolarization of microtubules, leading to damage  to  transport  vesicles  [35].  In  vitro  MTT  analysis  was  reported  to  be appropriate  to  determine  the  neuroprotective  effects  of  various  drugs  in  brain synaptosomal fractions of zebrafish and the results were found to be consistent with the results obtained from rats [24].

In  the  MTT  experiment,  when  mitoquinone  and  oleandrin  were  administered  as neuroprotective agents against rotenone toxicity, both agents increased mitochondrial activity. Oleandrin is a cardiac glycoside that binds and inhibits  Na + / K + -ATPase. Recently,  new  roles  of  cardiac  glycosides  in  the  regulation  of  various  cellular processes have been demonstrated. Leaves and flowers have been reported to be cardiotonic, diuretic, anticancer, antibacterial, anti-fungal and expectorant [36]. In recent years, Nerium oleander has been reported to have neuroprotective activity as the herbal anticancer candidate “PBI-05204” due to its oleandrin content [9]. The neuroprotective effect of oleandrin content of PBI-05204 has been suggested to be due to its neural BDNF expression enhancing effect [10].

In  conclusion,  our  study  showed  that  rotenone  exposed  zebrafish  is  suitable  for generating PD model through PD related genes, synuclein accumulation, oxidant- antioxidant   mechanisms   and   locomotor   activity.   In   addition,   the   effects   of mitochondria targeted antioxidant, mitoquinone was investigated for the first time in PD model and positive effects were demonstrated. Finally, the neuroprotective effect

of a heart glycoside, oleandrin has been shown for the first time in the literature in the case  of  rotenone  toxicity  in  synaptosomal  fractions  prepared  from  the  brains  of zebrafish. Reducing oxidative stress may provide a therapeutic strategy for PD, but further research is needed to elucidate the mechanisms involved. We believe our study will contribute to current data and therapeutic approaches related to PD. Conflicts of interest: The authors report no conflicts of interest.

Source of funding: This study was supported by Marmara University Scientific Research Projects Commission, Project No: SAG-C-YLP-120917-0506.

Acknowledgment

This study was supported by Marmara University Scientific Research and Project Commision, Project No: SAG-C-YLP-120917-0506

Accepted

REFERENCES

[1] Zhang ZX, Roman GC, Hong Z, Wu CB, Qu QM, Huang JB, Zhou B, Geng ZP, et al. Parkinson’s disease in China: prevalence in Beijing, Xian and Shanghai. Lancet 2005; 365:595-597.

[2]Weintraub D, Comella CL, Horn S. Parkinson’s disease Part 1: Pathophysiology, symptoms, burden, diagnosis, and assessment. Am J Manag Care 2008; 14:40-48

[3] Bernheimer H, Birkmayer W, Hornykiewicz O, Jellinger K, Seitelberger F. Brain dopamine and the syndromes of Parkinson and Huntington. Clinical, morphological and neurochemical correlations. J Neurol Sci 1973; 20:415–455.

[4]Cookson MR, Hardy J, Lewis PA. Genetic neuropathology of Parkinson’s disease. Int J Clin Exp Pathol 2008; 1:217-231.

[5] Xiong N, Long X, Xiong J, Jia M, Chen C, Huang J, Ghoorah D, Kong X, et al. Mitochondrial  complex  I  inhibitor  rotenone-induced  toxicity  and  its  potential mechanisms in Parkinson’s disease models. Crit Rev Toxicol 2012; 42:613-632.

[6] Burn DJ, Mark MH, Playford ED, Maraganore DM, Zimmerman TR, Duvoisin RC, Harding AE, Marsden CD, et al. Parkinson’s disease in twins studied with 18F- dopa and positron emission tomography. Neurology 1992; 42:1894-1900.

[7]Dickson  DW.  Neuropathology.  In:  Handbook  of  Parkinson’s  Disease,  4th  ed. (Pahwa R, Lyons KE, eds), 2007; pp 195-208. New York: CRC Press

[8] Murphy MP, Smith RA. Targeting antioxidants to mitochondria by conjugation to lipophilic cations. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2007; 47:629-656.

[9] Hong DS,  Henary H, Falchook  GS,  Naing A, Fu S, Moulder S,  Wheler JJ, Tsimberidou  A,  et  al.  First-in-human  study  of  pbi-05204,  an  oleander-derived inhibitor  of  akt,   fgf-2,  nf-κΒ   and  p70s6k,   in   patients   with   advanced  solid tumors. Invest New Drugs 2014; 32:1204-1212.

[10] Van Kanegan MJ, He DN, Dunn DE, Yang P, Newman RA, West AE, Lo AE. BDNF mediates neuroprotection against oxygen-glucose deprivation by the cardiac glycoside oleandrin. J Neurosci 2014; 34:963-968.

[11] Streisinger  G, Walker C, Dower N, Knauber D, Singer F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature 1981; 291:293-296.

[12] Doğanli C, Oxvig C, Lykke-Hartmann K. Zebrafish as a novel model to assess Na+/K+-ATPase-related neurological disorders. Neurosci Biobehav Rev 2013; 37:2774-2787.

[13] Holzschuh J, Ryu S, Aberger F, Driever W. Dopamine transporter expression distinguishes  dopaminergic  neurons  from  other  catecholaminergic  neurons  in  the developing zebrafish embryo. Mech Dev 2001; 101:237-243.

[14] Ünal İ, Emekli-Alturfan E. Fishing for Parkinson’s Disease: A review of the

literature. J Clin Neurosci  2019;62:1-6.

[15] Bretaud  S,  Lee  S,  Guo  S.  Sensitivity of  zebrafish  to  environmental  toxins implicated in Parkinson’s disease. Neurotoxicol Teratol 2004; 26:857-864.

[16] Wang Y, Liu W, Yang J, Wang F, Sima Y, Zhong ZM, Wang H, Hu LF, et al. Parkinson’s   disease-like   motor   and   non-motor   symptoms   in   rotenone-treated zebrafish. Neurotoxicology 2017; 58:103-109.

[17] Lowry O H, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ.  Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 1951;193:265-275.

[18] Yagi K. Assay for blood plasma or serum. Method enzymol 1984; 105:328-331.

[19] Miranda KM, Espey MG, Wink DA. A rapid, simple spectrophotometric method for simultaneous detection of nitrate and nitrite. Nitric oxide 2001; 5:62-71.

[20] Mylorie AA, Collins H, Umbles C, Kyle J. Erythrocyte superoxide dismutase activity  and  other  parameters  of  cupper  status  in  rats  ingesting  lead  acetate. Toxicol Appl Pharmacol 1986; 82:512-520.

[21] Habig WH, Jacoby WB. Assays for differentation of glutathion- s- transferases. Methods Enzymol 1981; 77:398-405.

[22] Livak KJ, Schmittgen TD.  Analysis of relative gene expression data using real- time quantitative PCR and the 2- ΔΔCT method. Methods 2001; 25:402-408.

[23] Dreiem A, Gertz CC, Seegal RF. The effects of methylmercury on mitochondrial function and reactive oxygen species formation in rat striatal synaptosomes are age- dependent. Toxicol Sci 2005; 87:156-162.

[24] Makhija DT, Jagtap AG.  Studies on sensitivity of zebrafish as a model organism for Parkinson’s disease: Comparison with rat model. J Pharmacol Pharmacother 2014; 5:39-46.

[25] Khotimah H, Sumitro SB, Widodo MA. Zebrafish Parkinson’s model: Rotenone decrease motility, dopamine, and increase α-synuclein aggregation and apoptosis of zebrafish brain. Int J PharmTech Res 2015; 8:614-621

[26] Santiago RM, Barbieiro J, Lima MM, Dombrowski PA, Andreatini R, Vital MA. Depressive-like behaviors alterations induced by intranigral MPTP, 6- OHDA, LPS and  rotenone  models  of  Parkinson’s  disease  are  predominantly  associated  with

serotonin   and   dopamine.   Prog   Neuropsychopharmacol   Biol   Psychiatry   2010; 34:1104–1114.

[27] Solesio ME, Prime TA, Logan A, Murphy MP, del Mar Arroyo-Jimenez M, Jordán J, Galindo MF. The mitochondria-targeted anti-oxidant MitoQ reduces aspects of mitochondrial fission in the 6-OHDA cell model of Parkinson’s disease. Biochim Biophys Acta 2013; 1832:174-182.

[28] Ghosh A, Chandran K, Kalivendi SV, Joseph J, Antholine WE, Hillard CJ, Kanthasamy A, Kanthasamy A, et al. Neuroprotection by a mitochondria-targeted drug in a Parkinson’s disease model. Free Radic Biol Med 2010; 49:1674-1684.

[29] Hatano T, Kubo S, Sato  S, Hattori  N. Pathogenesis  of familial  Parkinson’s disease: new insights based on monogenic forms of Parkinson’s disease. J Neurochem 2009; 111:1075-1093.

[30] Ariga H, Takahashi-Niki K, Kato I, Maita H, Niki T, Iguchi-Ariga SMM (2013) Neuroprotective Function of DJ-1 in Parkinson’s Disease. Oxid Med Cell Longev 2013:1-9

[31] Sarath Babu N, Murthy CLN, Kakara S, Sharma R, Swamy B, Cherukuvada V, Idris  MM.  1‐Methyl‐4‐phenyl‐1,  2,  3,  6‐tetrahydropyridine  induced  Parkinson’s disease in zebrafish. Proteomics 2016; 16:1407-1420.

[32] Howells DW, Porritt M, Wong JYF, Batchelor PE, Kalnins R, Hughes AJ, Donnan GA.  Reduced BDNF mRNA expression in the Parkinson’s disease substantia nigra. Exp Neurol 2000; 166:127-135.

[33] Milanese C, Sager JJ, Bai Q, Farrell TC, Cannon JR, Greenamyre JT, Burton EA. Hypokinesia and reduced dopamine levels in zebrafish lacking β- and γ1-synucleins. J Biol Chem 2012; 287:2971-2983

[34] Zhang L, Dawson VL, Dawson TM. Role of nitric oxide in Parkinson’s disease. Pharmacol Ther 2006; 109:33-41.

[35] Bove J, Prou D, Perier C, Przedborski S. Toxin-induced models of Parkinson’s disease. NeuroRx 2005; 2:484-494.

[36] Zibbu G, Batra A. A Review on Chemistry and Pharmacological activity of Nerium oleander L. J Chem Pharm Res 2010; 2:351-358

Figure 1: Locomotor activities of the groups. a  p<0.05 Significantly different from the C group c p<0.05 Significantly different from the MQ group

Accepted

Figure 2: A- Dopamine levels (ng/ml) of the groups; B-DOPAC levels (ng/ml) of the groups; C-Serotonin levels (ng/ml) of the groups; D-Noradrenalin levels (ng/ml) of the  groups.  E-DOPAC/Dopamine  levels  of  the  groups. a   p<0.05  Significantly different from the C group; b p<0.05 Significantly different from the R group c p<0.05 Significantly different from the MQ group.

Accepted

Figure 3: A- Lipid peroxidation (LPO) levels (nmol MDA/mg P) of the groups; B- Nitric oxide   (NO) levels (μmol/g P) of the groups; C-Glutathione-S- transferase (GST)  activities  (U/min  mg  P)  of  the  groups;  D-Superoxide  dismutase  activities (U/min mg P) of the groups a  p<0.05 Significantly different from the C group; b

the MQ group.

p<0.05 Significantly different from the R group c p<0.05 Significantly different from

Accepted

Figure 4: RT-PCR results. Bar graph presentation of the fold change of prkn, pink1, lrrk2 and bdnf transcripts quantified by RT-PCR. All RT-PCR results are normalized to β-actin, the house keeping gene and expressed as change from their respective controls. The average values were obtained from three experiments. Data presented are  mean  ±  SD.  Significant  difference  is  indicated  by  an  asterisk,  a p<0.05 Significantly different from the C group; b p<0.05 Significantly different from the R group  c  p<0.05  Significantly  different  from  the  MQ  group.  P-value  <0.05  was considered as significant.

Figure 5: Representative light micrographs of rhombencephalon in C (A), MQ (B), R (C)  and  MQ+R  (D)  groups  using  γ  Synuclein  immunohistochemical  staining. Moderate γ Synuclein immunopositive staining (arrows) was detected in the nerve cell bodies and processes (A, B and D). Strong γ Synuclein immunopositive staining (arrows) was observed in the nerve cell bodies and processes (C). Scale bar: 60 μM.